Usos de ADN recombinante

La tecnología del ADN recombinante es otra herramienta basada en ADN de gran importancia y que ha ganado atención popular en la década pasada.  Esta tecnología permite a los científicos encontrar genes individuales, seccionarlos, e insertarlos dentro del genoma de otro organismo.  La tecnología del ADN recombinante tiene aplicaciones en salud y nutrición.  En medicina, se usa para crear productos farmacéuticos tales como la insulina humana.  

En agricultura, se usa para impartir características favorables a la planta para incrementar su rendimiento y mejorar su contenido nutricional.

La tecnología del ADN recombinante requiere el uso de Tijeras moleculares denominadas enzimas de restricción, que cortan el ADN en secuencias específicas.  El gen seccionado es luego insertado dentro de una pieza circular de ADN bacterial denominado plasmidas.  La plasmida es luego reinsertada dentro de la célula bacterial.  Cuando la bacteria se multiplica, las plasmidas se multiplican también, creando muchas copias del gen.  Dado que la bacteria se multiplica muy rápidamente, grandes cantidades del gen pueden ser producidos en el laboratorio para análisis y aplicaciones posteriores.

Análogos de insulina: relevancia clínica y perspectivas futuras

Las insulinas humanas sintéticas o recombinantes son esencialmente idénticas a la insulina producida endógenamente por el páncreas endócrino, no solo en su estructura sino también en su farmacología.

Además son sustancialmente menos antigénicas que las insulinas de origen animal y administradas por vía subcutánea se absorben más rápidamente, actúan en menor período de tiempo y son de menor duración total. Estos parámetros farmacocinéticos deben ser considerados cuando se efectúe el cambio del tipo de insulina en los pacientes.

La tecnología DNA-recombinante ha sido también utilizada para producir análogos de la insulina como la insulina monomérica (no forma dímeros ni hexámeros) demás rápida acción, distribución y menor vida media y las insulinas de duración prolongada, que se obtienen sustituyendo los a.a. terminales de la cadena B. Estas

insulinas, tienen una vida media de más de 24 hs. y no son más antigénicas.

Los análogos de la insulina aún no tienen difusión en la terapéutica clínica.

TIPOS DE INSULINA

1. Insulina Zinc- cristalina

2. Insulina Zinc-protamina

3. Insulina isofánica o NPH (Neutral protarine Hagedorn).

4. Insulina Zinc-Globina

5. Insulinas lentas

Para solucionar medianamente esta problemática, han surgido nuevos análogos por técnicas de ADN recombinante con mayor eficiencia clínica, mediante sustitución, adición, inversión de aminoácidos o adición de ácidos grasos en su estructura química.

Referencias:

http://www.paternidad.com/science-technology/health-nutrition.html

http://www.iptv.org/exploremore/ge/what/insulin.cfm

http://med.unne.edu.ar/catedras/farmacologia/temas_farma/volumen2/cap25_insuli.pdf

http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/revfacmed/article/view/38442/40589

Diagnostico Molecular para la Diabetes

El diagnóstico molecular es un término general que engloba un conjunto de técnicas de biología molecular empleadas para la identificación de los defectos moleculares subyacentes en una enfermedad de carácter hereditario o bien para la detección de enfermedades infecciosas, ya sean de origen vírico, bacteriano o fúngico.

El diagnóstico molecular es de gran utilidad para la diabetes 1

Existen más de trece genes implicados en el desarrollo de la diabetes infantil, que supone el 15 por ciento de todos los casos de diabetes. El diagnóstico precoz, facilitado por las técnicas de biología molecular, es fundamental para evitar complicaciones a largo plazo.

Técnicas para el estudio del ADN

Existe una gran cantidad de técnicas para el estudio del ADN y cada una de ellas puede utilizarse con distintos objetivos dentro del estudio de la diabetes, como por ejemplo el diagnóstico de los diferentes tipos de MODY 1 (maturity-onset diabetes of the youth 1) o la presencia de

alelos de riesgo para la diabetes tipo 1. En la diabetes tipo 2 (DM2), los estudios se centran en la identificación de factores genéticos de riesgo para desarrollar la enfermedad o relacionados con el daño orgánico asociado.

También se están realizando algunos estudios de farmacogenética para conocer el efecto de diferentes polimorfismos en la respuesta al tratamiento.

• Secuenciación

La secuencia del ADN es el principal determinante de su función y estructura, de forma que pequeños cambios pueden alterarlas completamente. Para su análisis se han desarrollado varios métodos. El más importante es la secuenciación, y, dentro de ella, los procedimientos más utilizados actualmente se basan en la incorporación enzimática de dideoxinucleótidos marcados con fluorescencia.Esto puede lograrse mediante técnicas como la clonación en plásmidos o cósmidos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), etc.

• Estudio de polimorfismos

Una faceta muy importante del estudio del ADN es el análisis de la variabilidad del genoma humano y su influencia en nuestro fenotipo. Se calcula que en nuestro genoma existen más de 10 millones de variaciones de la secuencia del ADN (o polimorfismos) de diferentes tipos siendo los más frecuentes los polimorfismos de cambio de un nucleótido (SNP).

• Estudio de la metilación del ADN

Los cambios epigenéticos son modificaciones hereditarias que no suponen variaciones en la secuencia primaria del ADN y pueden permanecer durante varias generaciones.

Técnicas para el estudio del ARN

El estudio del ARN ofrece varias posibilidades, como el estudio de su secuencia, los procesados alternativos, el nivel celular, conocer qué genes se expresan en una célula o tipo celular, su nivel de expresión, su estabilidad, su degradación, su nivel de traducción, su estructura, etcétera. Principalmente se han analizado los cuatro primeros aspectos de los que pueden estudiarse en la diabetes.

Técnicas para el estudio de proteínas

Para el estudio de proteínas se están aplicando numerosas técnicas, especialmente las de cuantificación y las proteómicas, dada su utilidad en la investigación de enfermedades. Pese

a que en otros muchos aspectos relativos al estudio de una o varias proteínas se han hecho grandes avances técnicos en los últimos años, comentaremos tan sólo los dos primeros métodos citados, ya que el resto se aplica mucho menos en la investigación clínica y, en concreto, en la diabetes. La cuantificación de proteínas es una herramienta muy utilizada en numerosos estudios clínicos y básicos. Hasta hace unos pocos años, se cuantificaban las proteínas mediante sistemas sencillos basados en el reconocimiento de una proteína por un anticuerpo. Algunos de estos sistemas son el Western blot, el ELISA, el radioinmunoanálisis

(RIA) o las técnicas de inmunohistoquímica (para la cuantificación en un tejido o células). Algunos de los métodos basados en estas técnicas se han desarrollado, asimismo, para la cuantificación de la actividad de la proteína que va a analizarse.

Referencias:

• MARCADORES MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LA DIABETES MELLITUS
• Técnicas para el estudio del ADN y el ARN. Introducción al estudio de proteínas
• http://www.diariomedico.com/2008/03/03/area-cientifica/especialidades/cardiologia/actualidad/el-diagnostico-molecular-es-de-gran-utilidad-para-la-diabetes-1

Epigenetica de la Diabetes

La diabetes mellitus tipo 2 (T2DM, por sus siglas en inglés) es una enfermedad crónica multifactorial caracterizada por hiperglicemia, un resultado del deterioro en la función de las células beta pancreáticas y resistencia a la insulina por el hígado y tejidos periféricos objetivo, como el músculo esquelético y el tejido adiposo. En la resistencia a la insulina, las células corporales muestran una respuesta reducida a la insulina, lo que a su vez disminuye la liberación de glucosa en la sangre lo que lleva a mayor síntesis de glucosa en el hígado, y esto obliga a las células beta a compensar produciendo más insulina. Al final la pérdida de balance deriva en hiperglicemia. Los elevados niveles de glucosa en sangre (y deficiencia en los tejidos) pueden dañar órganos y llevar a complicaciones del sistema cardiovascular, ojos, neuronas y riñones, entre otros.

El papel de la epigenética

En 1992 se propuso que los factores ambientales experimentados en la vida temprana podían aumentar el riesgo de T2DM en la vida posterior. En particular, la desnutrición y el bajo peso al nacer mostraron una relación con la T2DM, la resistencia a la insulina y el deterioro en la secreción de insulina en la vida adulta. La nutrición inadecuada, al inducir alteraciones crónicas en el metabolismo, los niveles de hormonas y en el número de células, contribuye al riesgo de T2DM. La plasticidad en el desarrollo hace posible para el embrión humano temprano adaptarse a su ambiente en un momento dado, pero cuando la situación ambiental cambia, después en la vida, el beneficio del mejor uso de los nutrimentos se vuelve una desventaja. Como el genoma no puede cambiar, la programación ambiental puede ser mediada por la reprogramación epigenética.

Las células beta pancreáticas sintetizan y secretan insulina. La regulación de la expresión del gen de insulina (INS) no se comprende del todo, pero existe evidencia de involucramiento epigenético tanto de estudios sobre la estructura de la cromatina como en el nivel de metilación del DNA. En una línea de células beta de ratón, el promotor proximal Ins es hiperacetilado en los residuos lisina de la histona 3 (H3) e hipermetilado en la lisina 4 de H3 (H3K4), marcas asociadas con una estructura de eucromatina abierta y genes transcritos activamente. Estas marcas no son detectadas en las líneas celulares no beta.

Las células madre embrionarias tienen un patrón intermedio, consistente con su potencial para diferenciarse en una célula que expresa insulina. Adicionalmente, en las isletas pancreáticas humanas, el gen INS despliega un patrón de cromatina típico de los genes activos, incluyendo hiperacetilación de la histona 4 (H4) y dimetilación de H3K4 (H3K4me2). Estos padrones de modificaciones de histona no están presentes en otros tipos celulares, los que en su lugar despliegan niveles elevados de marcas inactivas. Los sitios CpG tanto en los promotores de ratónIns2 y humano INS, están desmetilados en las células beta productoras de insulina y la metilación de estos sitios suprime la expresión génica de insulina.

Evidencia importante sobre el papel de los factores epigenéticos en la patogénesis de T2DM proviene de los análisis de minado de datos (data mining) de más de 12 millones de registros Medline. El estudio encontró que la metilación y la cromatina se incluyen en os hits principales, relacionados implícitamente a la T2DM. Los fenotipos comunes involucrados en el surgimiento y patología de T2DM, los cuales son compartidos por enfermedades asociadas a cambios en la metilación del DNA, fueron también identificados; ejemplos son la expresión aberrante de los genes ligados a X, oncogénesis, surgimiento de la enfermedad de Huntington, en los cuales la probabilidad de enfermedad se incrementa con la edad. Similarmente, le surgimiento de T2DM tiende a ocurrir tarde en la vida, con una severidad que se incrementa con el tiempo.

Aunque existe apoyo para el papel de la epigenética en la patogénesis de T2DM, los estudios concluyentes en tejidos humanos son limitados. En un estudio, la S-adenosilmetionina (SAM), el principal donador fisiológico de grupos metilo, estuvo disminuido en los eritrocitos de pacientes con T2DM. Adicionalmente, una disminución en el donador de metilo estuvo asociada con la progresión de la enfermedad. En efecto, el tratamiento con SAM mejora la sensibilidad a la insulina en un modelo rata de resistencia a la insulina y T2DM, debido posiblemente a un incremento en la densidad de DNA mitocondrial en el músculo esquelético. Otro estudio funcional que evaluó a la epigenética en el tejido humano con T2DM concierne al coactivador 1-alfa del receptor activado por proliferador de peroxisoma gamma (PGC-1α, codificado por el gen PPARGC1A), un coactivador transcripcional de genes mitocondriales involucrado en la producción normal de ATP y la secreción de insulina por las células beta pancreáticas. El estudio mostró que el nivel de metilación de DNA es incrementado en una región promotora de PPARGC1A en las isletas pancreáticas de pacientes con T2DM, cuando se comparan con las isletas de donadores humanos sanos. Este incremento en la metilación de DNA se correlaciona con una disminución en la expresión del mRNA de PPARGC1A; adicionalmente, la expresión de PPARGC1A está positivamente correlacionada con la secreción de insulina estimulada por glucosa. Más aun, en el músculo esquelético de pacientes con T2DM, un incremento en la metilación del DNA es paralelo a un decremento en la expresión de mRNA dePPARGC1A y al contenido mitocondrial, con una alta proporción de metilación no-CpG en la región del promotor de PPARGC1A.

Referencias:
http://www.soched.cl/Revista%20Soched/3-2013/4.pdf
http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lcf/hernandez_r_sc/capitulo4.pdf
http://nutricionpersonalizada.wordpress.com/2011/04/26/epigenetica_diabetes_mellitus_tipo_2/

Alteraciones en la Traducción en la Diabetes

RESUMEN
Las mitocondrias son orgánulos subcelulares que tienen como misión principal la producción de energía, los cuales contienen su propio sistema genético que codifica un número pequeño de proteínas que forman parte del sistema de fosforilación oxidativa. En los últimos años han sido descubiertas mutaciones en el material genético mitocondrial que originan las enfermedades mitocondriales. Con el objetivo de contribuir a elevar y actualizar el conocimiento acerca del tema se realizó una revisión bibliográfica, donde se expone, además, la relación de las mitocondrias con afecciones como el alzheimer, el parkinson y la diabetes mellitus, por citar algunas.

ENFERMEDADES MITOCONDRIALES Las mutaciones en proteínas mitocondriales pueden conducir a un descenso en la producción de ATP, formación de radicales libres y alteraciones en la homeostasis del calcio en la célula, por ejemplo: en la paraplejía espástica hereditaria se encuentra mutada la paraplegina, una metaloproteasa mitocondrial que da lugar a defectos en la fosforilación oxidativa.

Diferentes estudios han sugerido que mutaciones del ADNmt y disfunciones de la cadena respiratoria pueden estar implicadas en la patogénesis de la diabetes mellitus.

En primer lugar, mutaciones del ADNmt asociadas con encefalopatías mitocondriales se han identificado bien en estos pacientes; en segundo lugar, es más frecuente heredar la diabetes mellitus de una madre afecta que de un padre con la enfermedad, lo cual sugiere una herencia materna de los factores predisponentes. En estudios in vitro se ha demostrado que son necesarios el DNAmt y la cadena respiratoria intacta para la liberación de insulina mediada por la glucosa. Este hecho sugiere que mutaciones del DNAmt u otras causas que alteren la función de la fosforilación oxidativa de las células beta de los islotes pancreáticos, pueden originar una reducción de la secreción de insulina y, por tanto, desarrollar la diabetes mellitus.

Referencias:
http://bvs.sld.cu/revistas/san/vol_16_5_12/san16512.htm
http://naukas.com/2014/04/28/genetica-de-tronos-iv-daenerys-mhysa-madre-de-dragones-herencia-materna-y-ceguera/
http://aepmi.org/wordpress/patologias/

ALTERACIONES EN LA TRANSCRIPCIÓN DE PACIENTES CON DIABETES

La diabetes mellitus tipo 2 es una enfermedad que se asocia a un riesgo incrementado de enfermedad coronaria y que en la actualidad está adquiriendo el rango de pandemia en nuestra sociedad. Estudios epidemiológicos han demostrado que la resistencia a la insulina y la constelación de alteraciones metabólicas asociadas, como la dislipemia, la hipertensión, la obesidad y la hipercoagulabilidad, influyen en la prematuridad y severidad de la aterosclerosis que desarrollan los pacientes con diabetes mellitus. La relación entre la resistencia a la insulina y el proceso aterogénico es directa, pero también muy compleja. Es probable que la complejidad derive de la interacción que existe entre genes predisponentes a la resistencia a la insulina con otros que, independientemente, regulan el metabolismo lipídico, el sistema de coagulación y la biología de la pared arterial.

El factor de transcripción nuclear kappa-beta regula la expresión de genes que codifican proteínas proinflamatorias, claves en el desarrollo de la placa de ateroma, y que en el estado de resistencia a la insulina existen múltiples factores activadores que pueden explicar la precocidad y severidad del proceso aterogénico. Las glitazonas, un nuevo grupo de antidiabéticos orales, son agonistas de otro factor de transcripción nuclear, el receptor activado del peroxisoma proliferador. De manera experimental, estos agentes han demostrado mejorar la sensibilidad periférica a la insulina y retardar la progresión de la aterosclerosis, posiblemente debido, entre otros mecanismos, a su efecto antiinflamatorio.

Resistencia a la insulina, hiperinsulinemia y factor nuclear- *ß


Actualmente conocemos que muchos de los genes que codifican proteínas clave en la respuesta inflamatoria de la aterosclerosis son modulados por el factor de transcripción nuclear- ß (NF- ß ). El NF-ß reside de forma inactiva en el citoplasma de diversos tipos celulares y se activa por numerosos estímulos como el estrés oxidativo, las citocinas, diversos mitógenos, etc. Su activación induce la expresión de interleucinas, TNF- * , INF- * , moléculas de adhesión, metaloproteinasas y otros factores proinflamatorios clave en el desarrollo y la progresión de la aterosclerosis.Sabemos que el aumento de la actividad de este factor de transcripción nuclear se correlaciona con la extensión y severidad de la enfermedad coronaria (García-Moll et al, datos no publicados) y con la actividad de la placa. Recientemente se ha demostrado de manera experimental que la insulina per se no activa el NF- ß , pero potencia el efecto de la hiperglucemia, los AGE y la angiotensina II en la activación del NF- ß , lo que ha llevado a la hipótesis de que en el microambiente resultante de la resistencia a la insulina existen múltiples factores que pueden activarlo y, en consecuencia, acelerar el proceso de la aterosclerosis.

Diabetes tipo MODY

Fue previamente considerada como el tercer tipo de diabetes tipo 2. Sin embargo, con el descubrimiento de las mutaciones que resultan en MODY, ahora se la clasifica como diabetes secundaria u otros tipos de diabetes. MODY también se caracteriza por presentarse antes de los 25 años de edad y todos los casos hasta la fecha han demostrado una deficiencia en función de las células β del páncreas. Los pacientes también pueden presentar resistencia a la insulina y una deficiencia tardía de las células β. La evidencia indica que las mutaciones en 10 a 12 genes distintos han sido correlacionadas con el desarrollo de MODY. Mutaciones en los 8 genes descritos a continuación, han sido asociadas a la presentación de MODY:

MODY1: el factor de transcripción identificado como el factor nuclear hepático- 4α (HNF-4α)
MODY2: glucocinasa pancreática

MODY3: el factor de transcripción HNF-1α. Este gen también se conoce como el factor de transcripción del hepatocito- 1 (TCF1).
MODY4: el factor promotor de la insulina-1 factor de transcripción del homeodominio (IPF-1). Este gen es más comúnmente conocido como PDX1 derivado del "homeobox-1" del páncreas y duodeno.
MODY5: El factor de transcripción HNF-1β. Este gen también se conoce como el factor de transcripción del hepatocito-2 (TCF2).
MODY6: el factor de transcripción NeuroD1 bHLH. El NeuroD1 fue inicialmente identificado como un gen inductor del desarrollo neural. El gen del hámster β2 se ha demostrado que regula la transcripción de la insulina y es idéntico al gen Nuero D1, por lo cual se lo denomina NeuroD/β2. MODY6 es una rara forma de MODY.
MODY7: el factor Krupple-como 11 (KLF11) la proteína es un factor de transcripción de cinc-dedo que está implicado en la activación de el promotor de la insulina. KLF11 es un factor de transcripción de TGF-β-inducible
MODY8: el gen de la lipasa carboxilo-éster (CEL) que participa en el metabolismo de los lípidos. Frameshift deleciones en la variable número de repeticiones en tándem (VNTR) del gen de la CEL se asocian con MODY8 que es caracterizado por pancreática exocrina y la disfunción de las células β.

Referencias:
http://www.revespcardiol.org/es/diabetes-mellitus-inflamacion-aterosclerosis-coronaria/articulo/13013868/
http://themedicalbiochemistrypage.org/es/diabetes-sp.php
http://www.sediabetes.org/resources/revista/00011316archivoarticulo.pdf